HER2检测，免疫组化，荧光原位杂交，乳腺癌分子分型，样本前处理，ISH判读，质量控制，报告解读
样本获取与前期固定
HER2检测的基石始于一份合格的肿瘤样本。临床上主要采用手术切除标本、空心针穿刺活检标本或转移灶活检标本。这里要注意，样本的及时与规范固定是后续所有分子结果准确性的生命线。核心固定剂为10%中性缓冲福尔马林，其pH值需维持在7.2-7.4之间。固定时间有严格窗口：穿刺标本需固定6-72小时，手术大标本需固定8-48小时，并确保福尔马林能充分渗透。固定不足会导致抗原降解，影响免疫组化染色；固定过度则会引起核酸交联，增加FISH检测的难度。说实话，很多实验室的检测偏差，根源往往出在这个最初、最容易被忽视的环节。样本离体后应在30分钟内浸入足量固定液（体积比为1:10），并做好详尽的样本标识与信息登记，确保全程可追溯。
组织处理与切片制备
固定后的组织需经过脱水、透明、浸蜡等一系列标准化流程，最终包埋成石蜡块。脱水梯度乙醇的浓度、浸蜡的温度与时间均需精确控制，以最大限度保持组织形态与抗原/核酸完整性。制备用于检测的切片时，技术要点颇多。用于免疫组化的切片厚度通常为3-5微米，需使用防脱载玻片，并在60℃烘烤适当时间以确保组织紧密附着。用于FISH检测的切片则更厚，约4-5微米，同样要求平整无皱褶。划重点，必须由病理医师在HE染色切片上圈定出典型的浸润性癌区域，该区域应避开坏死、出血及重度炎症区。依据此标记，技术人员再进行连续切片，确保IHC和FISH检测的是同一群肿瘤细胞，这是保证结果一致性的关键前提。
免疫组化实验操作
免疫组化是HER2蛋白表达水平的初筛方法。实验流程包括脱蜡水化、抗原修复、内源性过氧化物酶阻断、一抗孵育、二抗孵育、显色及复染封片。其中，抗原修复是打开因固定而遮蔽的抗原表位的关键步骤，通常采用热诱导表位修复法。一抗即抗HER2单克隆抗体，其克隆号、稀释度、孵育时间和温度必须严格遵循试剂说明书及实验室标准操作程序。设立阳性和阴性对照是质控的核心：阳性对照通常为已知HER2阳性的乳腺癌组织，阴性对照则为用PBS替代一抗的对照切片。实验结果的判读依据ASCO/CAP指南，采用0、1+、2+、3+的评分系统。0和1+判为阴性，3+判为阳性，而2+则属于“不确定”或“临界值”，必须进行FISH检测以明确基因状态。
荧光原位杂交检测
FISH检测是判定HER2基因是否扩增的“金标准”，尤其用于IHC 2+病例的确诊。实验从切片脱蜡开始，随后进行预处理以去除蛋白，接着使用蛋白酶消化以暴露靶核酸。消化程度至关重要，消化不足会导致探针穿透困难，消化过度则会破坏组织形态。消化后，将HER2基因特异性探针（通常标记为红色荧光）和位于17号染色体着丝粒的CEP17探针（标记为绿色荧光）与靶DNA进行共变性、杂交。杂交后洗脱以去除未结合探针。最后，在荧光显微镜下，使用特定滤光片观察细胞核内的红绿信号。一个完整的FISH检测，其实吧，难点不仅在于杂交本身，更在于杂交前的预处理优化，这需要根据实验室条件进行细致摸索和标准化。
数据分析与信号判读
FISH结果的判读是一项高度专业化的工作。分析者需在荧光显微镜下或通过数字图像分析系统，计数至少20个浸润性癌细胞核中的HER2和CEP17信号数目。计算HER2/CEP17信号比值的平均值，并记录HER2信号的平均拷贝数。根据最新指南，判读标准如下：HER2/CEP17比值≥2.0且平均HER2拷贝数≥4.0，判为阳性；比值<2.0且平均HER2拷贝数<4.0，判为阴性。对于比值<2.0但平均HER2拷贝数≥6.0的特殊情况，也考虑为阳性，这反映了多体性可能。此外，比值≥2.0但平均HER2拷贝数<4.0的情况较为罕见，需谨慎复核。你想啊，计数时必须选择信号清晰、无重叠的完整细胞核，并排除切片边缘或人为干扰区域，判读的客观性与一致性是报告可信度的保障。
内部与外部质量控制
为确保检测结果的准确可靠，贯穿全程的质量控制体系不可或缺。内部质控包括：每批次IHC/FISH实验必须运行阳性和阴性对照，且结果符合预期；定期对仪器设备进行校准与维护；建立标准操作程序并严格执行；对技术人员进行持续培训和能力评估。外部质控则更为重要，即参与权威机构组织的室间质评活动。实验室需定期接收质评机构发放的未知样本，独立完成检测并上报结果，由机构进行评价。连续通过室间质评是实验室检测能力获得认可的基本条件。任何质控环节的失败，都必须启动偏差调查，追溯原因并采取纠正措施，直至问题解决。
报告整合与临床解读
最终的报告并非简单罗列IHC或FISH数据，而是一份整合了病理形态、蛋白表达与基因状态的综合诊断文件。报告应清晰注明检测方法、所用抗体/探针克隆号、判读标准（指南版本）、具体结果（IHC评分、FISH比值与拷贝数）以及最终的诊断结论（阳性、阴性或不确定）。对于IHC 2+且FISH阴性的病例，结论应为“HER2阴性”；对于IHC 0/1+但临床高度怀疑的罕见病例，可备注说明“蛋白表达阴性，未检测到基因扩增”。报告解读需结合临床背景，例如，对于原发灶与转移灶结果不一致的情况，应在报告中予以提示。一份严谨的报告，是连接精准检测与临床靶向治疗决策的最终桥梁。
